A spin decay assay for tumor necrosis factor cytotoxicity.

Tumor necrosis factor (TNF) is believed to elicit its response primarily by an oxidative process. We present a sensitive biophysical assay system to monitor TNF-induced cell killing by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy using the spin label 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-n-oxyl (TEMPO). The rate of TEMPO spin decay by the TNF sensitive L929 cells was hypothesized to be an indicator of TNF cytolytic response. The cell-induced rate of loss of TEMPO signal was sensitive to concentration as well as time of incubation with TNF. The TEMPO spin decay first derivative plot correlated well with corresponding TNF cytotoxicity curve as obtained by a standard tetrazolium dye reduction bioassay. While dimethyl sulfoxide (DMSO) (up to 500 mM) and alpha-tocopherol (1 mM) inhibited the TNF induced inhibition of rate of loss of TEMPO decay, superoxide dismutase (SOD) (100 U/ml), catalase (1000 U/ml), and histidine (6 mM) had little effect on the TEMPO decay rate. The loss of TEMPO signal was determined to be at an outer domain of the lipid bilayer as illustrated by its decay and broadening in presence of NiCl2. Thus the reduction of a lipid soluble spin label like TEMPO as monitored by EPR could be a useful reporter to study TNF cytotoxicity in target cells.

Generación de factores quimiotácticos para macrófagos alveolares, después de la instilación con asbesto crisotilo / Generation of chemotactic factors for alveolar macrophages after chrysotile asbestos instillation

Los modelos experimentales de asbestosis han demostrado que la respuesta inflamatoria inicial está mediada por macrófagos alveolares (MA). Aunque la atracción y acumulación de MA vistos en nuestros modelos está fundamentalmente mediada por el complemento, se ha sugerido la participación de otros factores quimiotácticos no bien caracterizados. En este trabajo, buscamos la presencia de factores quimiotácticos en ratas instiladas con asbesto en forma aguda. Demostramos morfoñlógicamente que el depósito de fibras, la respuesta macrofágica y las lesiones inducidas, son equivalentes a lo reportado en modelos por inhalación. Evaluamos la actividad quimiotáctica en el lavado broncoalveolar (LBA) fraccionado de acuerdo a su peso molecular (PM), y la presencia de albúmina y complemento. Encontramos actividad quimiotáctica en las fracciones del LBA correspondientes a picos de alto y bajo PM. La actividad del primer pico se atribuyó al complemento. La actividad del segundo, aumentó conforme al tiempo de exposición y no parece estar relacionada con complemento. Para identificar otros factores quimiotácticos diferentesa complemento, determinamos la presencia de factor de necrosis tumoral (TNFÿ) y fibronectina (FN) en los LBA no fraccionados. No se detectaron diferencias en la cantidad de TNF presente en los diferentes grupos. Observamos un incremento en la concentración de FN en relación al tiempo de exposición. Aunque la presencia de fracciones de FN pudiera explicar parcialmente el fenómeno quimiotáctico observado con el pico de bajo úPM, no podemos descartar la participación de otros factores no identificados